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합성 방법 및 과정

합성 방법은 Koster 의해 개발된 b-cyanoethyl phosphoramidite를 이용하여 DNA 구조의 골격을 이루는 phosphodiester 결합을 연결해가는 'phosphite triester' 방법이 가장 보편적 입니다. 합성 시 사용되는 Phosphoramidite monomer는 생체 또는 시험관에서 일어나는 효소적 합성과는 달리 화학적인 일련의 반응이기 때문에 4종의 염기, 인산기, 5′수산기 등 많은 작용기(functional group)가 있어, 각 단계에서 원하는 화학반응만이 일어나도록 다른 작용기들을 보호기로 보호 해야 합니다.

합성 방법 및 과정 그림

Phosphoramidite monomer는 coupling을 위해 활성화되기 전에는 상당히 안정화되어 있어 장기 보관도 가능하고 또한 이를 이용한 합성시간도 다른 방법에 비해 짧다는 장점을 지니고 있습니다.

3'쪽 끝의 nucleoside를 움직이지 못하도록 고형 지지체 (solid support)에 결합 한 후 컬럼에서 반응시킴으로 합성이 이루어 지며, 이 CPG에서부터 시작하여 Deblocking > Coupling > Oxidation > Capping 으로 이루어지는 Cycle을 반복함으로써 3' 방향에서 5'방향으로 단일염기를 하나씩 붙이면서 Oligonucledtide를 신장시키는 자동화된 합성기기를 (합성효율 : >98%) 이용하여 합성하게 됩니다.

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  • Deblocking (Detritylation)
    합성의 첫 단계에서는 지지체(support)에 부착된 뉴클레오시드 유도체의 5′-OH를 보호하고 있는 DMTr기를 Trichloroacetic acid(TCA)를 처리하여 제거하여 다음 coupling 단계에서 phosphoroamidite와 반응할 수 있는 유리 5′-OH를 얻는 과정 입니다. 이 과정을 Deblocking (Detritylation)이라 하며, 이때 DMT 양이온은 진한 주황색을 띄는 부산물로 생성됩니다. 이 부산물의 흡광도를 이용하여 coupling 효율 등 단계별로 합성효율을 측정하는데 이용됩니다.
  • Coupling
    새로운 염기가 생성되는 phosphoroamidite가 5' 말단에 붙는 단계입니다. Phosphoramidite는 화학적으로 변형된 nucleoside로, 4가지 화합물의 산화 환원 반응에 의하여 coupling이 일어 나며, Tetrazol (TET)과 phosphoramidite는 tetrazolyl phosphoramidite라는 활성화된 중간 물질을 통해 지지 체의 5'히드록시기와 반응하여 internucleotide phosphite를 형성 합니다. Coupling에 관여하는 반응물은 5′-OH기와 양적으로 빨리 반응이 이루어져야 하며 합성이 용이하고 정제과정이 간편해야 할 뿐만 아니라 H2O 나 O2와 반응하지 않는 안정한 화합물이어야 합니다. coupling 전에 지지체 (support)는 acetonitrile로 철저히 세척하여 뉴클레오시드와 친화성이 있는 물질을 제거해야 하며, 잔여 acetonitrile은 아르곤 가스를 역류하여 건조 제거를 철저하게 해야 높은 coupling효율을 얻을 수 있습니다.
  • Capping
    새로운 염기가 결합되지 못하게 5'-OH group을 불활성 시키는 단계입니다. Coupling은 항상 정량적이 아니므로 지지체 (support)에 부착된 소량 (보통 0-2%)의 뉴클레오티드는 부가반응에 관여하지 않을 수도 있습니다. 이렇게 반응되지 않은 DNA 사슬이 다음 부가반응에서 신장되지 못하도록 잔존 유리 5′-OH기를 acetylation시켜 capping해야 하며, acetic anhydride와 N-metylimidizole(NMT)이 동량, 동일 몰 농도로 동시에 컬럼 으로 전달되면 강력한 acetylation 시약과 5′-OH 기가 반응하여 불활성화 되어 capping 됩니다.
  • Oxidation
    새롭게 형성된 nucleotide linkage를 산화과정을 통해 안정화 시키는 단계입니다. 새로 만들어진 뉴클레오티드 결합은 3가인 phosphite의 triester입니다. phosphite 결합은 불안정하여 산과 반응하면 절단되기 쉬워 capping 후에 3가 phosphite triester를 안정한 5가 phosphite triester로 산화시켜야 합니다. Iodine은 산소의 공여체인 물과 tetrahydrofuran(THF) 용액에서 약산화제로 작용하며, Iodine 용액은 다음 화학반응에서 유해하므로 acetonitrile로 확실히 제거해야 됩니다.
  • 합성주기의 종결
    Oxidation후 한 개의 뉴클레오티드 첨가가 1회 합성 주기입니다. 합성하려는 올리고뉴클레오티드의염기서열에 따라 상기 4 단계별 반응을 반복하여 합성이 완결되면 5′-말단에는 여전히DMTr기가 남아 있는 상태가 되는데 합성 DNA의 정제방법에 따라 Trityl기가 부착된 상태 또는 제거된 상태로 합성을 종결합니다.

Oligonucleotide 제품생산 및 QC 과정

Oligonucleotide 제품생산 및 QC 과정 그래프
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  • DMT (Trityl monitoring)에 의한 합성 상태 검사
    합성 중 DMT기를 분리 시 진한orange color가 나타나게 됩니다. 이 color의 농도를 UV 흡광도 측정을 통하여 합성의 효율과 합성 상태를 확인 할 수 있습니다. 이 과정을 coupling 반응의 DMT monitoring (trityl monitoring)이라 합니다.
  • Deprotection
    자동화 기기에서 합성된 Oligo를 고형 지지체 (CPG)에서 분리 및 Protection group을 제거를 위한 공정 입니다. 일반적으로 55℃에서 8시간, 상온에서 24시간 정도 소요 됩니다.
  • 정제
    합성된 올리고의 부산물을 제거 과정과 순도를 높이는 과정 입니다. Oligonucleotide synthesis는 100%의 효율이 나올 수 없습니다.
    99%의 coupling efficiency가정하에 합성효율을 다음과 같습니다.
    합성효율
    Percentage Yield of Full-Length and Failed Oligonucleotides by Length
    Length (no. of bases) Product (%) Failure (%)
    10 91 9
    20 83 17
    50 61 39
    75 48 52
    100 37 63
    만약 50mer oligo를 합성한다고 가정하면61%가 full length이고 나머지 39%는 deletion 또는 truncation 된 mutant 입니다. 즉, 합성길이가 길어지면 (n-1)mer의 확률이 상대적으로 증가하게 되므로, 분자량에 따른 PAGE 정제를 통하여 목적 major 단편만 선별하여 사용하시면 그 확률을 최소화 할 수 있습니다.
    본사는 고순도 oligo 생산을 위해 RP 정제를 기본으로 하고 있습니다.

실험목적에 적합한 정제 방법

실험목적에 적합한 정제 방법
Application Desalted Purified
Antisense Recommended HPLC
cDNA Library Generation   HPLC/PAGE
Cloning   HPLC
Crystallography   2 Step HPLC/2 Step PAGE
End Labeling   HPLC
FISH   HPLC
Gel Shift Assay   HPLC/PAGE
Gene Synthesis   HPLC/PAGE
Genotyping   HPLC
Hybridization Recommended  
Kinasing Recommended  
Mutagenesis   HPLC/PAGE
Oligo Probes Recommended  
PCR Recommended*  
Primer Extension   HPLC
RT-PCR   HPLC
Sequencing Recommended  

RP 정제

RP 정제란?
DMT ON 방식으로 합성된 올리고를 cartridge 방식의 Reverse phase column를 이용하여 50mer 미만의 올리고 합성시 발생되는 부산물 및 minor product 제거 합니다. 합성기 상에서 올리고의 마지막 cycle이 끝난 뒤 DMT기를 떼어내지 않고 합성과정을 완료하면 마지막 N-mer 올리고에만 DMT기가 존재하고 나머지 부산물들에는 (N-1,N-2…) DMT기가 없는 상태로 합성이 완료 됩니다. 이 DMT기는 Hydrophobic한 성질이 있어 RP resin과의 친화성이 크게 나타나 DMT기가 없는 N-1,N-2…mer들을 제거함으로써 원하는 N-mer oligo를 정제 할 수 있습니다. 일반적인 PCR, probe hybridization 뿐만 아니라, sequencing, cloning, site mutagenesis (30mer이하 권장)에서도 사용가능 한 것으로 나타났으며, 본사에서 제공되는 모든 oligo에 적용되는 정제 방식입니다.
RP-Colum 정제 전, 후 HPLC DATA
RP-Colum 정제 전, 후 HPLC DATA

RP-HPLC 정제

RP-HPLC 정제란?
RP-HPLC (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography) Column을 이용하여 정제 하는 방법입니다. 올리고의 Hydrophobic한 성질을 이용하여 major sequence를 분리해 내는 방법으로 35mer미만의 oligo에 적합 하며 modification oligo 사용시 이 정제법을 권장합니다.

PAGE 정제

PAGE 정제란?
긴 올리고을 고순도로 정제할 시에 사용되는 정제 방법으로 PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)을 이용하며 보통 100mer 정도까지 높은 정제 효율을 보입니다. DMT OFF방식으로 합성된 올리고를 Polyacrylamide Gel Electrophoresis를 통하여 major sequence만을 분리하는 방법으로 n-1mer 까지 분리 가능 합니다. 정제 후 순도가 98% 이상을 나타내는 반면 Gel에서 회수하는 공정에서 손실이 많은 단점이 있습니다. sequencing, cloning, site mutagenesis를 목적으로 하거나, 50mer 이상의 올리고, 일부 modification oligo는 PAGE에 의한 정제법을 권장합니다.